当代健康(原标题:食管癌基因筛查 食管癌组织PTCH1基因和蛋白表达临床意义的研究)
张戈 张晓伟 邵先玉 陈振华
泰山医学院隶属医院消化科, 山东泰安270000
【摘要】意图：评论Hedgehog信号通路中PTCH1基因及蛋白在食管癌、癌旁安排及正常食管安排中的表达及其临床含义。办法：选用实时荧光定量PCR技能检测40例食管癌及其相应的癌旁安排和10例正常食管安排中PTCH1mRNA的表达，并使用免疫组化技能检测PTCH1蛋白的表达，剖析其与患者年纪、性别、肿瘤巨细、分解程度、搬运等临床病理要素的联系。成果：食管癌安排PTCH1mRNA的表达为4.75（2.56-9.09），高于癌旁安排0.80（0.4-1.52）和正常安排1（0.592-1.69），P＜0.05，差异有计算学含义。PTCH1mRNA的表达及PTCH1蛋白与食管癌安排类型和病理类型有关，与患者年纪、性别、肿瘤巨细等无关。定论：PTCH1基因和蛋白在食管癌中高表达，与食管癌的发作开展有关，标明在HH信号通路中PTCH1 基因和蛋白或许是诱发食管癌的原因之一，其检测或许成食管癌临床确诊的新标志物或医治的新靶点。
Clinical significance of PTCH1 gene and protein expression in esophageal cancer tissues
CHEN Zhen-hua , ZHANG Ge,ZHANG Xiao-wei, SHAO Xian-yu
Department of Gastroenterology, Affiliated Hospital of Taishan Medical College, Taian 270000,P.R.China
【Abstract】Objective：To investigate the expression of PTCH1 gene and protein about Hedgehog signal in patients with esophageal carcinoma，precancerous tissues and normal tissues. Method: Using the real-time PCR and immunohistochemistry to detect the expression of PTCH1mRNA in 40 cases esophageal carcinoma , the relative tissues and 10 cases normal esophageal tissues, and analyze its relationship with age ，gender，tumor size，degree of differentiation and lymphatic moving.
Result: The expression of PTCH1 gene in esophageal cancer was 4.75（2.56-9.09），which was higher than that of precancerous tissues 0.80（0.4-1.52）and normal tissues 1（0.592-1.69）. The difference was statistically significant（P＜0.05）. The expression of PTCH1 gene and PTCH1 protein is concerned with degree of differentiation and pathological type ,which was not concerned with age ，gender，tumor size and lymphatic moving.The staining depth about PTCH1 protein in esophageal cancer was stronger than that of normal tissue and precancerous tissues，and the staining depth in squamous cell carcinoma was stronger than that in adenocarcinoma. Conclusion:The expression of PTCH1mRNA and PTCH1 protein is high in esophageal tissues，which may be concerned with the development of esophageal carcinoma. So the detection of PTCH1 gene and protein may become a new clinical diagnosis marker in patients with esophageal carcinoma or as a new target in treatment of esophageal cancer.
【关键词】HH信号系统；食管癌；PTCH1基因；RT-PCR;实时荧光定量PCR;免疫组化；
Keywords: Hedgehog signal system; esophageal cancer; PTCH1 gene; RT-PCR; real-time fluorescence quantitative PCR；immunohistochemistry.
食管癌是现在世界上最为常见的十种恶性肿瘤之一, 每年有超越300 000新发病例，预后较差，五年生存率不到10％[1]。前期确诊是现在进步食管癌患者生存率和治愈率的有用办法，食管癌相关的肿瘤标志被以为是前期确诊的有用办法之一。有研讨证明，Hedgehog信号通路反常激活与多种实体肿瘤的发作密切相关。本研讨经过实时荧光定量PCR检测Hedgehog（HH）信号通路中PTCH1基因和蛋白在食管癌安排的表达，并与正常食管安排和食管癌旁安排进行比较，剖析其表达率与食管癌临床病理目标的联系，评论PTCH1基因在食管癌中效果及或许的发作机制。
1资料与办法
1.1标本来历
搜集2010-01-01-2012-01-31我院胸外科手术切除的食管癌及癌旁安排各40例，另经胃镜取正常食管安排10例，一切标本搜集后均敏捷液氮冻存。一切患者术前均未行放化疗，亦无其他肿瘤，均经病理确诊。40例食管癌中，食管鳞癌34例,食管腺癌6例。
1.2首要试剂和仪器
Trizol RNA提取试剂及Ultra SYBR Mixture （北京康为世纪生物科技有限公司）；Revert Aid TM榜首链cDNA Synthesis试剂盒（赛默飞世尔科技公司）；DNA Ladder Marker （上海信然原装生物试剂）；PTCH1和RPLPO引物（上海桑尼生物公司）；DEPC水（上海生工生物工程有限公司）；琼脂糖（生兴生物技能南京有限公司）；荧光定量PCR仪（类型Rotor-gene Q）；鼠抗人PTCH1蛋白单克隆抗体（一抗）（上海文渊阁生物科技有限公司）；兔抗鼠免疫组化试剂盒（上海文渊阁生物科技有限公司）；DAB（上海生工生物工程有限公司）.
1.2办法
1.2.1安排总RNA的提取 取液氮中冻存的癌安排、癌旁安排及正常食管安排约80mg置于玻璃匀浆器中，参加1mL Trizol试剂于匀浆器中，然后敏捷匀浆，整个匀浆进程中均置于冰上。再参加200μl氯仿,12000g,4℃，15min离心；取上层水相，参加0.5ml异丙醇，8000g，4℃，10min离心；倒掉上清，75%乙醇，8000g，4℃，5min离心。食管癌安排、癌旁安排和食管正常安排提取RNA后，分光光度计测定稀释50倍的总RNA，取A260:A280比值为1.8～2.0的RNA进行凝胶电泳，并于紫外透射反射剖析仪下调查，凝胶成像剖析系统摄像。
1.2.2反转录按Revert Aid TM榜首链cDNA Synthesis试剂盒阐明书进行操作。
1.2.3实时荧光定量PCR PCR反响系统按康为世纪Ultra SYBR Mixture办法进行。
1.2.4 PTCH1mRNA相对定量表达剖析选用比较阈值法，经过检测意图基因PTCH1和管家基因RPLPO基因的CT值来核算ΔCT、ΔΔCT、2-ΔΔCT等，评论不同安排表达的差异。本试验选用相对定量中的比较CT法，以正常食管安排作为基准，来核算食管癌旁安排与癌安排中PTCH1 mRNA 的表达量。比较40例食管癌安排的PTCH1 mRNA的表达量与肿瘤巨细、病理类型、有无搬运、安排学类型之间的联系，并以正常食管安排的PTCH1 mRNA的表达量为参阅目标，
1.2.5免疫安排化学染色选用EnVision二步法进行免疫组化染色调查PTCH1在不同安排中的表达，染色进程依照阐明书进行，选用微波抗原修正，一抗4℃过夜，DAB显色。
1.3成果判别规范
倒置显微镜下调查并拍照安排染色相片，选用IPP6.0图片剖析软件剖析并核算每个安排的DAB显色积分光密度值(OD)，以邵建国[2]等一篇题为胰腺癌安排中PTCH蛋白免疫组化检测的文章为判别规范：PTCH1定坐落细胞膜上，阳性染色为棕黄色。于光镜下随机计数1000个细胞，核算染色细胞所占的百分比，小于20%为阴性（-），大于20%为阳性，阳性的染色强度分为+（淡黄色），++（黄色），+++（棕黄色）。依据每组阳性及阴性例数的多少比较不同安排PTCH1蛋白表达的多少。
1.4 计算学办法
使用SPSS13.0计算软件包对所得数据进行单要素方差剖析，正常安排、癌旁安排、癌安排的ΔCT等数据均选用X±S的方式标明，查验水准α=0.05。
2成果
2.1总RNA判定
电泳首要用于检测RNA的完整性，依据凝胶电泳成果显现，至上而下三个条带分别为28、18和5S，三条带显现明晰，阐明从食管安排、癌旁安排、癌安排提取RNA具有完整性（图1）。
图1 不同安排总RNA电泳图
Marker： DNA Ladder Marker；1：食管正常安排;2: 食管癌安排;3: 食管癌安排;4: 食管癌旁安排
2.2PTCH1 mRNA 在三种安排的表达
正常安排PTCH1mRNA的表达量为1（0.592-1.69），癌旁安排的表达量为0.80（0.4-1.52），二者比较P＞0.05，差异无计算学含义；癌安排表达量为4.75（2.56-9.09），与正常安排比较，P＜0.05，差异有计算学含义；癌安排与癌旁安排比较，P＜0.05，差异有计算学含义
2.3 PTCH1mRNA与食管癌患者临床病理要素的联系成果（表1）。依据表1成果，PTCH1mRNA的表达与年纪、性别、肿瘤巨细、有无搬运无关，与食管癌安排类型、病理类型有关，在食管鳞癌中表达高于腺癌，低分解型高于高中分解型。
表1 食管癌安排中PTCH1 m RNA的表达与临床病理参数
项目
n
ΔCT
ΔΔCT
2-ΔΔCT
P值
年纪
≥55岁
30
7.62±0.54
-2.18±0.54
4.84(3.80-5.90)
＜55岁
10
7.68±0.34
-2.13±0.34
4.47(3.14-5.80)
0.679
性别
男性
26
7.76±0.38
-2.04±0.38
4.25(3.60-4.90)
女人
14
7.40±0.0.60
-2.41±0.60
5.69(3.56-7.84)
0.069
肿瘤巨细
直径＞3cm
15
7.70±0. 57
-2.11±0.57
4.63(3.03-6.24)
直径≤3cm
25
7.60±0.44
-2.21±0.44
4.83(3.79-5.87)
0.805
安排类型
鳞癌
34
7.49±0.42
-2.32±0.42
5.19(4.32-6.06)
腺癌
6
8.23±0.16
-1.58±0.16
3.00(2.50-3.50)
0.017
病理类型
高中分解
25
7.90±0.36
-1.91±0.36
3.86(3.24±4.48)
低分解
15
7.25±0.39
-2.56±0.39
6.09(4.64±7.55)
0.002
有无搬运
有搬运
8
7.76±0.42
-2.05±0.42
4.88(3.90-5.85)
无搬运
32
7.61±0.51
-2.20±0.51
4.27(2.32-6.21)
0.538
2.4PTCH1蛋白的表达
表2不同食管安排PTCH1蛋白的表达
标本安排
PTCH1蛋白
算计
阳性
表达率
-
+
++
+++
正常食管安排
5
4
1
0
10
50%
癌旁安排
19
14
5
2
40
52.50%
食管癌安排
10
9
10
11
40
75%
表3PTCH1与食管癌临床病理参数表
项目
数量
PTCH1蛋白阳
性表达数量
PTCH1蛋白阳
性表达百分比
P
年纪
≥55岁
30
23
76.67%
＞0.05
＜55岁
10
7
70.00%
性别
男性
26
20
76.92%
＞0.05
女人
14
10
71.43%
肿瘤巨细
直径＞3cm
15
11
73.33%
＞0.05
直径≤3cm
25
19
76.00%
安排类型
鳞癌
34
28
82.35%
＜0.05
腺癌
6
2
33.33%
病理类型
高中分解
25
16
64.00%
＜0.05
低分解
15
14
93.33%
有无搬运
有搬运
8
5
62.50%
＞0.05
无搬运
32
25
78.13%
3 评论
食管癌的切当病因不明，现以为其发作是多要素一起效果的成果，包含易感要素，遗传要素、环境要素等等。本文首要从基因信号学视点对食管癌进行研讨，一起对PTCH1蛋白进行了检测。成果标明：试验所用安排中PTCH1mRNA均有表达，癌安排中表达显着增高，高于癌旁安排和正常安排，癌旁安排和正常安排间PTCH1基因表达无差异；其表达水平在病理类型上食管鳞癌高于腺癌，基因有必要经过表达相应蛋白发挥效果，经过免疫组化对蛋白的检测，与PTCH1 mRNA的检测具有一致性；PTCH1 mRNA在安排分解程度上低分解者高于中高分解者，由此可得出食管癌的恶性程度与PTCH1mRNA的表达具有相关性，恶性程度越高，其表达越高;与性别、年纪、有无淋巴搬运、肿瘤巨细无关（P＞0.05）。
长期以来，研讨人员估测与胚胎发育密切相关的信号传导基因在癌变进程中具有重要效果。这一估测首要在对皮肤痣样基底细胞癌、髓母细胞瘤、横纹肌肉瘤的研讨中得到了证明[3]。HH信号通路首要由排泄型信号糖蛋白SHH配体、跨膜蛋白受体PTCH和另一跨膜蛋白SMO组成的复合物，以及下流转录因子GLI蛋白(Gli1、Gli2、Gli3)组成【4】。HH信号通路是一个经典的操控胚胎发育的信号传导通路，在哺乳动物中广泛存在，操控细胞的成长与增殖，而肿瘤细胞无限扩增亦是其成长增殖失控的进程。PTCH1作为HH信号通路中一员，定位在9q22·3，其可发作骤变、表达改动(表达增高、减低或缺失）、甲基化润饰等，均可引起许多潜在改动，失掉对SMO的按捺，激活信号通路，进一步激活靶器官。Anca Oniscu[5]等研讨标明HH信号通路参加结肠癌变的进程，且在HH通路中SHH、PTCH和SMO在结肠息肉、结肠腺瘤和结肠癌中的表达量逐步添加。Nielsen等[6]研讨发现在胰管癌安排中PTCH1 mRNA的平均水平显着要高于接近的正常安排。山东大学马晓丽教授等[7]对99例前期胃癌进行研讨,发现63例标本中存在PTCH1或GLI的高表达，并使用别的一种药物环靶明（HH信号通路按捺剂）下降PTCH1和GLI表达，可使细胞成长受限甚至凋亡。王树俊[8]等使用免疫组化清晰了35例食管癌和癌旁安排中PTCH和SHH的高表达表达，估测PTCH和SHH及HH的激活参加了食管癌的发作，或许是食管癌医治的一个抱负靶点。
PTCH1基因在食管癌中的表达经过本试验得出：（1）在癌安排中表达高于癌旁安排和正常安排；（2）在鳞癌中表达高于腺癌；（3）低分解癌中表达量高于高中分解癌。PTCH1作为HH信号通路中的一员，其表达在食管癌中增高，或许使得与SMO构成的复合体发作改动，继而诱发HH信号通路反常激活有关，这或许是引起食管癌的机制之一，其检测有或许成为新的临床确诊食管癌的标志物或许医治食管癌的新靶点。
参阅文献
[1] Stathopoulos GP, Tsiaras N. Epidemiology and pathogenesis of esophageal cancer : management and its controversial results. OncolRep,2003,10(2): 449- 454.
[2] 邵建国，许国铭，屠复兴，等，胰腺癌安排中PTCH蛋白免疫组化检测[J].第二军医大学学报，2005,26（8）：950-951.
[3] Scales S, de Sauvage F Mechanisms of Hedgehog pathway activation in cancer and implications for therapy. Trends Pharmacol Sci ,2009,30: 303–312.
[4] Ruiz I,Altaba A.Therapeutic inhibition of hedgehog-GLI signaling in cancer: epithelial，stromal，or stem cell targets? [J]. Cancer Cell ，2008, 14(4): 281-283.
[5] Anca Oniscu, Roberta M James, Robert G Morris, Scott Bader, Roger DG Malcomson and David J Harrison.Expression of Sonic hedgehog pathway genes is altered in colonic neoplasia[J].Journal of Pathology,2004;203:909-917.
[6] Nielsen S K,Mollgard K,Clement CA,et al.Characterization of primary cilia and Hedgehog signaling during development of the human pancreas and in human pancreatic duct cancer cell lines[J].Dev Dyn,2008,237(8):2039-2052.
[7] Xiaoli Ma,Kai Chen,Shuhong Huang,Xiaoli Zhang,Patrik A.Adegboyega,B,Mark
Evers,Hongwei Zhang and Jingwu Xie.Frequent activation of the hedgehog pathway in advanced gastric adenocarcin omas [J].Carci nogens is,2005,(26):1 698- 1705.
[8] 王树俊，张剑，裘宋良，等，Shh 和Ptch 在食管鳞状细胞癌中的表达研讨[J]. 根底和临床肿瘤学杂志,2006,3(19):172-174.
